在過(guò)去的二十多年中，固相萃取作為化學(xué)分離和純化的一個(gè)強(qiáng)有力工具出現(xiàn)了。從痕量樣品的前處理到工業(yè)規(guī)模的化學(xué)分離，吸附劑萃取在制藥、精細(xì)化工、生物醫(yī)學(xué)、食品分析、有機(jī)合成、環(huán)境和其他領(lǐng)域起著越來(lái)越重要的作用。
固相萃取的原理
在過(guò)去的二十多年中，固相萃取作為化學(xué)分離和純化的一個(gè)強(qiáng)有力工具出現(xiàn)了。從痕量樣品的前處理到工業(yè)規(guī)模的化學(xué)分離，吸附劑萃取在制藥、精細(xì)化工、生物醫(yī)學(xué)、食品分析、有機(jī)合成、環(huán)境和其他領(lǐng)域起著越來(lái)越重要的作用。
固相萃取是一個(gè)包括液相和固相的物理萃取過(guò)程。在固相萃取中，固相對(duì)分離物的吸附力比溶解分離物的溶劑更大。當(dāng)樣品溶液通過(guò)吸附劑床時(shí)，分離物濃縮在其表面，其他樣品成分通過(guò)吸附劑床；通過(guò)只吸附分離物而不吸附其他樣品成分的吸附劑，可以得到高純度和濃縮的分離物。
保留和洗脫
在固相萃取中最通常的方法是將固體吸附劑裝在一個(gè)針筒狀柱子里，使樣品溶液通過(guò)吸附劑床，樣品中的化合物或通過(guò)吸附劑或保留在吸附劑上（依靠吸附劑對(duì)溶劑的相對(duì)吸附）。“保留”是一種存在于吸附劑和分離物分子間吸引的現(xiàn)象，造成當(dāng)樣品溶液通過(guò)吸附劑床時(shí)，分離物在吸附劑上不移動(dòng)。保留是三個(gè)因素的作用：分離物、溶劑和吸附劑。所以，一個(gè)給定的分離物的保留行為在不同溶劑和吸附劑存在下是變化的。“洗脫”是一種保留在吸附劑上的分離物從吸附劑上去除的過(guò)程，這通過(guò)加入一種對(duì)分離物的吸引比吸附劑更強(qiáng)的溶劑來(lái)完成。
容量和選擇性
吸附劑的容量是在最優(yōu)條件下，單位吸附劑的量能夠保留一個(gè)強(qiáng)保留分離物的總量。不同鍵合硅膠吸附劑的容量變化范圍很大。選擇性是吸附劑區(qū)別分離物和其他樣品基質(zhì)化合物的能力，也就是說(shuō)，保留分離物去除其他樣品化合物。一個(gè)高選擇性吸附劑是從樣品基質(zhì)中僅保留分離物的吸附劑。吸附劑選擇性是三個(gè)參數(shù)的作用：分離物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、吸附劑的性質(zhì)和樣品基質(zhì)的組成。
固相萃取的簡(jiǎn)要過(guò)程
1.一個(gè)樣品包括分離物和干擾物通過(guò)吸附劑；
2.吸附劑選擇性的保留分離物和一些干擾物，其他干擾物通過(guò)吸附劑；
3.用適當(dāng)?shù)娜軇┝芟次絼瓜惹氨Ａ舻母蓴_物選擇性的淋洗掉，分離物保留在吸附劑床上；
4.純化、濃縮的分離物從吸附劑上淋洗下來(lái)。
SPE 的方法建立
1. 選擇SPE 小柱或?yàn)V膜 首先應(yīng)根據(jù)待測(cè)物的理化性質(zhì)和樣品基質(zhì), 選擇對(duì)待測(cè)物有較強(qiáng)保留能力的固定相。若待測(cè)物帶負(fù)電荷, 可用陰離子交換填料, 反之則用陽(yáng)離子交換填料。若為中性待測(cè)物, 可用反相填料萃取。SPE 小柱或?yàn)V膜的大小與規(guī)格應(yīng)視樣品中待測(cè)物的濃度大小而定。對(duì)于濃度較低的體內(nèi)樣品, 一般應(yīng)選用盡量少的固定相填料萃取較大體積的樣品。
2. 活化 萃取前先用充滿小柱的溶劑沖洗小柱或用5～ 10ml 溶劑沖洗濾膜。一般可先用甲醇等水溶性有機(jī)溶劑沖洗填料, 因?yàn)榧状寄軡?rùn)濕吸附劑表面, 并滲透到非極性的硅膠鍵合相中, 使硅膠更容易被水潤(rùn)濕, 之后再加入水或緩沖液沖洗。加樣前, 應(yīng)使SPE 填料保持濕潤(rùn), 如果填料干燥會(huì)降低樣品保留值; 而各小柱的干燥程度不一, 則會(huì)影響回收率的重現(xiàn)性。
3. 加樣 一般可采取以下措施: (1) 用0. 1 mol/L 酸或堿調(diào)節(jié), 使pH < 3 或pH > 9, 離心取上層液萃取; (2) 用甲醇、乙腈等沉淀蛋白質(zhì)后取上清液, 以水或緩沖液稀釋后萃取; (3) 用酸或無(wú)機(jī)鹽沉淀蛋白質(zhì)后取上清液, 調(diào)節(jié)pH 值后萃取; (4) 超聲15 min后加入水、緩沖液, 取上清液萃取。尿液樣品中的藥物濃度較高, 加樣前先用水或緩沖液稀釋, 必要時(shí)可用酸、堿水解反應(yīng)破壞藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合, 然后萃取。流速應(yīng)控制為2～ 4 m l?m in, 流速快不利于待測(cè)物與固定相結(jié)合。
4. 清洗填料 反相SPE 的清洗溶劑多為水或緩沖液, 可在清洗液中加入少量有機(jī)溶劑、無(wú)機(jī)鹽或調(diào)節(jié)pH 值。加入小柱的清洗液應(yīng)不超過(guò)一個(gè)小柱的容積, 而SPE 濾膜為5～ 10 m l。
5.洗脫待測(cè)物 應(yīng)選用5～ 10m l 離子強(qiáng)度較弱但能洗下待測(cè)物的洗脫溶劑。若需較高靈敏度, 則可先將洗脫液揮干后, 再用流動(dòng)相重組殘留物后進(jìn)樣。體內(nèi)樣品洗脫后多含有水, 可選用冷凍干燥法。保留能力較弱的SPE 填料可用小體積、較弱的洗脫液洗下待測(cè)物,再用極性較強(qiáng)的HPLC 分析柱如C18柱分析洗脫物。若待測(cè)物可電離, 可調(diào)節(jié)pH 值, 抑制樣品離子化, 以增強(qiáng)待測(cè)物在反相SPE 填料中的保留, 洗脫時(shí)調(diào)節(jié)pH 值使其離子化并用較弱的溶劑洗脫, 收集洗脫液后再調(diào)節(jié)pH 值使其在HPLC 分析中達(dá)到最佳分離效果。在洗脫過(guò)程中應(yīng)減慢流速, 用兩次小體積洗脫代替一次大體積洗脫, 回收率更高。
固相萃取技術(shù)在環(huán)境分析上的應(yīng)用
在環(huán)境污染中農(nóng)藥分析的應(yīng)用
國(guó)內(nèi)外分析工作者就固相萃取技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用方面進(jìn)行了廣泛的嘗試和探索,取得了許多成功的經(jīng)驗(yàn). 由于農(nóng)藥在農(nóng)作物生產(chǎn)中不僅污染作物本身,對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)環(huán)境也產(chǎn)生污染,包括土壤、水體等.
SPE 在水體中農(nóng)藥殘留分析方面的應(yīng)用
測(cè)定水體中的農(nóng)藥殘留一般采用如C18 ,C8 等非極性吸附劑,通常用甲醇和水條件化,以甲醇為洗脫劑.由于對(duì)水體中的農(nóng)藥殘留限量要求嚴(yán)格,如歐盟規(guī)定地表水農(nóng)藥殘留量為1.0μg/ L，飲用水為0.1μg/ L,我國(guó)規(guī)定生活飲用水中滴滴涕、六六六的限量分別為1μg/ L 和5μg/ L,而且自然水體中的農(nóng)藥殘留質(zhì)量濃度通常也很低,若沒(méi)有可靠的分離富集手段很難檢測(cè)到,采用固相萃取技術(shù)可以使提取、富集和凈化一步完成. 將大體積樣品過(guò)固相萃取柱進(jìn)行預(yù)濃縮,用小體積洗脫劑洗脫,再濃縮定容進(jìn)行檢測(cè),大大降低了檢測(cè)方法的檢出限. 如:康躍慧等人測(cè)定水源水中有機(jī)磷,通過(guò)固相萃取富集分離后,使方法檢出限達(dá)到了1.19～5. 34 ng/L;Lopez-Blanco 等測(cè)定地表水中的硫丹(α和β異構(gòu)體) ,采用固相萃取實(shí)現(xiàn)了樣品的100 倍濃縮富集,使方法檢出限達(dá)到20 ng/L; Pinto 等測(cè)定水中草凈津等4 種除草劑,采用固相萃取富集樣品使?jié)饪s倍數(shù)達(dá)到500 倍,方法檢出限降低至9.8～34 ng/ L.但對(duì)于水溶性強(qiáng)的農(nóng)藥品種如甲胺磷、樂(lè)果、敵敵畏等,回收率僅50 %～60 % ,甚至更低 ,因此在今后的工作中應(yīng)著眼于如何提高這些農(nóng)藥品種的回收率,提高方法的準(zhǔn)確度.
SPE 在土壤中農(nóng)藥殘留分析方面的應(yīng)用
測(cè)定土壤中的農(nóng)藥殘留一般是先用適當(dāng)?shù)奶崛∪軇┘疤崛》绞綇耐寥罉悠分袑⒋郎y(cè)的農(nóng)藥提取出來(lái),再利用固相萃取技術(shù)進(jìn)行凈化. 由于待測(cè)農(nóng)藥的性質(zhì)不同所使用的提取溶劑不同,因此從基質(zhì)中帶來(lái)的雜質(zhì)性質(zhì)也不盡相同,所以要選擇適當(dāng)?shù)奈絼?shí)現(xiàn)待測(cè)殘留農(nóng)藥的分離和凈化.分析極性較強(qiáng)的農(nóng)藥,采用極性較強(qiáng)的提取溶劑如丙酮-水體系時(shí)可采用非極性吸附劑如C18等,這樣提取溶劑中水溶性強(qiáng)的雜質(zhì)不會(huì)保留在吸附劑上,有利于樣品的凈化,如Ruiz 等利用V (水) ∶V (DMF) = 100∶2.5 為提取溶劑、C18為吸附劑,以乙酸乙酯為淋洗劑測(cè)定土壤中莠去津,呋喃丹,地亞農(nóng)等農(nóng)藥取得了較好的效果;而分析極性較弱的農(nóng)藥,采用極性較弱的提取溶劑時(shí),可以選擇極性吸附劑如Florisil 等,它不會(huì)對(duì)提取溶劑中的弱極性雜質(zhì)產(chǎn)生保留,然后再選擇適當(dāng)溶劑將待測(cè)殘留農(nóng)藥淋洗下來(lái)進(jìn)行測(cè)定,如Kim 等利用V(正己烷)∶V (二氧甲烷) = 7∶3 為提取溶劑、Florisil 為吸附劑測(cè)定土壤中α,β-HCH ,七氯等有機(jī)氯農(nóng)藥食品有毒物質(zhì)分析中的應(yīng)用近兩年,國(guó)外有些學(xué)者已經(jīng)開(kāi)始將SPE 用于食品中一些毒素的提取和凈化,如食品中有機(jī)氯、有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測(cè)定,蔬菜水果中胺基甲酸酯類(lèi)、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的測(cè)定,Carmichael和Aase 等人分別用C18 提取了被細(xì)菌污染的牡蠣中的麻痹毒素和致腹瀉毒素,優(yōu)化了這些毒素的標(biāo)本提取步驟。Fiori 等人對(duì)于牛奶中非法添加的地塞米松等9 種皮質(zhì)類(lèi)固醇用SPE 法進(jìn)行了提取,聯(lián)合LC- MS 進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定水平為20～100ng/g。Skog對(duì)過(guò)高溫度燒烤肉食中的致癌物質(zhì)—雜環(huán)胺進(jìn)行了提取,并用GC - MS 法對(duì)提取物進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其濃度常可達(dá)10-9 水平。
有毒藥物分析中的應(yīng)用
固相萃取技術(shù)在有毒藥物分析中的應(yīng)用已不再只停留于血、尿等體液中的巴比妥類(lèi)、卡馬西平、安非它明類(lèi)、阿片類(lèi)等藥物的提取和凈化, Hold 等人為研究毒品在毛發(fā)中的代謝機(jī)制,將人的毛發(fā)用酶消化后, 調(diào)pH 為5. 5 , 然后過(guò)固相柱,蒸發(fā)濃集后,聯(lián)合GC - MS 同時(shí)測(cè)定毛發(fā)中的可卡因、阿片以及它們的代謝物(咖啡因,愛(ài)康寧等) ,檢測(cè)限均可達(dá)到500pg/mg。
富集環(huán)境空氣中痕量有機(jī)化合物
環(huán)境空氣污染物中揮發(fā)性及半揮發(fā)性物質(zhì)占90 % ,其余為顆粒狀污染物;顆粒狀污染物可用濾膜捕集,對(duì)揮發(fā)性和半揮發(fā)性一般用固相萃取(固體吸附) ,溶液吸收和低溫冷凝富集采樣。固相萃取富集環(huán)境空氣中有機(jī)物是將均勻粒度的固定相裝成小柱,在常溫或低溫下使空氣通過(guò)小柱,由于氣相(空氣) 與固定相之間對(duì)有機(jī)化合物的分配系數(shù)不同而將欲捕集的化合物保留在小柱上,空氣中正常組分如氮、氧等則通過(guò)小柱流出,達(dá)到富集有機(jī)化合物的目的。
固相萃取及其在臨床生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用
隨著生化技術(shù)的發(fā)展,從復(fù)雜的生物樣品(血、尿、體液、糞便) 中提純并富集痕量物質(zhì)是現(xiàn)代分析技術(shù)必不可少的步驟。通過(guò)樣品的預(yù)處理,去除生物樣品中與待測(cè)物不相關(guān)的其他物質(zhì),并富集其濃度在可測(cè)定的線性范圍內(nèi),這就要求預(yù)處理的特異性、重復(fù)性及回收率要高,而且不破壞待測(cè)物本身的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。以前常用離心、蒸餾、過(guò)濾、沉淀和真空冷凍、干燥等方法,但對(duì)復(fù)雜樣品中低濃度待測(cè)物來(lái)說(shuō),上述方法難以滿足要求。液-液萃取作為氣相色譜( gas chromatography ,GC) 和其他色譜的預(yù)處理,曾一度非常流行,但它費(fèi)時(shí)、易乳化、雜質(zhì)較多、需要樣品量大,并且需要一些有毒或有污染的有機(jī)溶劑,重現(xiàn)性和精密度較差,安全無(wú)毒的溶劑很少,且價(jià)格昂貴。為了彌補(bǔ)上述缺點(diǎn),人們又發(fā)明了一較新的萃取方法———固相萃取(solid-phase ext raction ,SPE)，SPE 已廣泛應(yīng)用于各行各業(yè),包括生物樣品中各種內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的分離、純化;藥物分析中的安眠類(lèi)藥物、抗組胺藥物、抗抑郁藥物、局麻藥物、興奮藥物等的檢測(cè);法醫(yī)學(xué)中的毒物分析(安非他明、大麻類(lèi)、有機(jī)磷、麻醉劑、氰化物等) 及環(huán)境監(jiān)測(cè)中某些金屬離子的測(cè)定。