尼克酸（維生素PP，又稱煙酸）的測定方法
此處介紹微生物法、比色法以及復合維生素制劑中的煙酰胺測定方法（分光光度法）
一、微生物法
1.原理
一種微生物生長必需某一些維生素，Lactobacillusarabinosus的生長需要尼克酸。尼克酸是指具有尼克酸生物學活性的吡啶3-羧酸及其衍生物的總稱。它是白色晶體，是維生素中最穩定的一種，對酸、堿、熱、光及弱氧化劑都很穩定，微溶于冷水，易溶于熱水及乙醇。其檢出限為10ng。
2.適用范圍
本方法來源自AOAC和國標GB12395-90。適用于食物及飼料中的尼克酸的檢測。
3.儀器
（1） 電熱恒溫培養箱(37±0.5℃)
（2） 無菌室（紫外燈消毒）
（3） 電熱手提式壓力蒸汽消毒器（121℃，高壓30min）
（4） 液體快速混合器
（5） 離心機（3000轉，10min）
（6） 堿式滴定管
（7） 硬質玻璃試管
4.試劑
所用試劑皆為分析純；所用水皆為蒸餾水
4.1 標準溶液的配制
（1）尼克酸標準儲備液（0.1mg/ml）：準確稱取50.0mg已干燥恒重并儲于五氧化二磷干燥器中的尼克酸標準，以25%乙醇溶液溶解并定容至500ml，于冰箱中保存。
（2）尼克酸標準中間液（1ug/m）：吸取1.00ml尼克酸標準儲備液，置于100ml容量瓶中，用25%乙醇溶液定容，混勻，于冰箱中保存。
（3） 尼克酸標準工作液（0.1ug/m）：臨用時吸取5.00ml尼克酸標準中間液，置于50ml容量瓶中，用水定容，混勻。
4.2 其它試劑的配制
（1） 0.5mol/L硫酸：于2000ml燒杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀釋至1000ml。
（2） 10mol/L氫氧化鈉：溶200g NaOH于水中，稀釋至500ml。
（3） 0.1mol/L氫氧化鈉：，取10ml 10mol/L NaOH，用水稀釋至1000ml。
（4） 0.04%溴甲酚綠溶液，稱取0.1g溴甲酚綠于研缽中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少許水繼續研磨，直至完全溶解，用水稀釋到250ml。
（5）酪蛋白（sigma公司）：稱取50g不含維生素的酪蛋白，加200ml（3mol/L）鹽酸，121℃磅壓力下水解6小時，將水解物轉移至蒸發皿內，在水浴上蒸發至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發至膏狀，反復3次，以除去鹽酸。
注意：*酸解酪蛋白是為了去除酪蛋白中的維生素，確保培養基中不含代測的尼克酸，但酸解并不一定徹底，因此選用不含維生素的酪蛋白。
*水浴蒸發時不可蒸干或使之焦糊，若溶液被蒸干，水解液所含營養物已被破壞
用10mol/L氫氧化鈉調節PH值至3.5，以溴酚藍作外指示劑。加20g活性炭，振搖，過濾，反復操作至濾液無色。濾液加水稀釋至500ml，加少許甲苯置冰箱中保存。
*注意：活性炭不能在溶液中太久，否則容易破壞酪蛋白的營養成分
（6） 溴酚藍：稱取0.1g溴酚藍，用1+4乙醇溶解后，再加乙醇稀釋至100ml。
（7） 甲苯
（8） 4mol/L鹽酸溶液，V+V=1+4
（9） 5mol/L生理鹽水：取9gNaCl溶于1000ml水中。
（10）胱氨酸、色氨酸溶液：稱取4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸溶于800ml水中，加熱至70～80℃，逐滴加入20%鹽酸，不斷攪拌，直至完全溶解為止。冷至室溫，加水稀釋至1000ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
（11）腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液：稱取硫酸腺嘌呤，鹽酸鳥嘌呤及尿嘧啶各0.1g，加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉淀產生，加濃鹽酸數滴，再加熱。如此反復，直至冷卻后無沉淀產生為止。用水稀釋至100ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
（12）D-泛酸鈣、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆醇溶液：稱取D-泛酸鈣、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆醇各10mg于燒杯中，以水溶解并稀釋至1000ml，將此液置于棕色瓶中，加少許甲苯于冰箱中保存。
*注意：此溶液見光分解，因此儲存于棕色瓶中
（13） 0.02mol/L醋酸溶液：取1.18ml純的冰醋酸，稀釋至1000ml
（14）核黃素、鹽酸硫胺素、生物素溶液：溶解1mg生物素結晶于100ml0.01747mol/L的醋酸中，取此液4ml（相當于40ug生物素），加入20mg核黃素和10mg鹽酸硫胺素，以0.01747mol/L醋酸溶解并稀釋至1000ml，將此液置于棕色瓶中，加少許甲苯于冰箱中保存。
*注意：此溶液見光分解，因此儲存于棕色瓶中
（15） 甲鹽溶液：取25g磷酸氫二鉀和25g磷酸二氫鉀，加水溶解后稀釋至500ml，加少許甲苯于冰箱中保存。
（16）乙鹽溶液：取10g硫酸鎂、0.5g氯化鈉、0.5g硫酸亞鐵和0.5g硫酸錳，加水溶解后稀釋至500ml，加5滴濃鹽酸，加少許甲苯于冰箱中保存。
（17） 乙醇溶液 V/V=1/3
（18） 溴酚藍：稱取0.1g溴酚藍，用1+3乙醇溶液溶解后，再稀釋至100ml。
（19）0.04%溴麝香草酚藍溶液：稱取0.1g溴麝香草酚藍于研缽中，加1.6ml，0.1mol/LNaOH，研磨，加少許水繼續研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
（20） 0.004%溴麝香草酚藍溶液：量取100ml0.04%溴麝香草酚藍溶液，加水稀釋至1000ml，供滴定用。
（21） 基本培養基儲備液：
酸解酪蛋白 50ml
胱氨酸、色氨酸溶液 50ml
腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液 10ml
D-泛酸鈣、對氨基苯甲酸、吡哆醇溶液 10ml
核黃素、鹽酸硫胺素、生物素溶液 10ml
甲鹽溶液 10ml
乙鹽溶液 10ml
無水葡萄糖 10g
無水醋酸鈉 10g
（或結晶醋酸鈉NaAC.3H2O 16.6g）
將上列試劑混合，用水稀釋至500ml用氫氧化鈉調PH至6.8，以溴麝香草酚藍作外指示劑。
（22） 瓊脂培養基：
無水葡萄糖 1g
醋酸鈉 1g
蛋白胨 0.8g
酵母提取物干粉 0.2g
甲鹽溶液 0.2ml
乙鹽溶液 0.2ml
瓊脂 1.2g
混合，加水至100ml，加熱至瓊脂完全溶化，以溴麝香草酚藍為外指示劑，用鹽酸趁熱調PH至6.8，盡快倒入試管中，每管3～5ml，加塞棉塞，于壓力蒸汽消毒器中121℃滅菌10min，取出后豎直試管，冷至室溫后保存于冰箱中。
4.3菌種的制備與保存
（1） 菌種的制備與保存：以阿拉伯乳酸桿菌?Lactobacillus arabinosus 17-5 ATCC No.8014簡稱Lact.A?純菌種接入2個或多個瓊脂培養基管中，在37±0.5℃恒溫箱中保溫16-24小時，取出于冰箱中保存，至多不超過兩周。保存數周以上的菌種，不能立即用作制備接種液之用，一定要在使用前每天轉種一次，連續2-3天，方可使用，否則生長不好。
（2） 種子培養液的制備：加5ml0.1ug/ml的尼克酸標準應用液于尖頭試管中，加入5ml基本培養基，塞好棉塞，于壓力蒸汽消毒器內（高壓鍋）121℃下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保存數周之久。
5.操作步驟
5.1樣品制備：取含尼克酸約5-50ug的均勻樣品于100ml三角瓶中，加0.5mol/LH2SO450ml。放入高壓蒸汽鍋121℃下水解30min，取出，于水中冷卻，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4調PH值至4.5，用溴甲酚綠做指示劑。將三角瓶內的溶液轉移到100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至100ml，濾紙過濾，保存濾液于冰箱內備測（保存期不超過36小時）。
*用0.5mol/L硫酸水解，可以斷開尼克酸和其它物質結合的鍵，使尼克酸游離出來。
*觀察溴甲酚綠至草綠色為終點，說明溶液PH值到了4.5.調PH值至4.5可以除去樣品中刺激和抑制細菌生長的物質，如：淀粉、脂肪酸及磷脂。許多蛋白質的等電點也在PH4.5，所以此PH值也可用來沉淀蛋白質。
5.2接種液的制備：使用前一天，將阿拉伯乳酸桿菌菌種由儲備菌種管移種于已消毒的種子培養液中，可同時制備兩管，在37±0.5℃的恒溫箱中培養16-24小時。取出離心10分鐘（3000rpm）傾去上部液體，用已消毒的生理鹽水淋洗2次，再加10ml消毒過的生理鹽水，將離心管置于液體快速混合器上混合，使菌種成為混懸體，將此液倒入已消毒的注射器內，立即使用。
5.3樣品標準曲線的測定：3組試管各加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0ml工作液，每管加水稀釋至5ml，再加5ml基本培養基，混勻，加棉塞。
5.4試樣的測定：在試管中分別加入1，2，3，4ml樣液，加水稀釋至5ml，再加入5ml基本培養基，用棉塞塞住試管，將制備好的標準曲線和試樣測定管放入高壓鍋（121℃）高壓10min，冷至室溫備用。
5.5接種和培養：每管種一滴接種液，于37±0.5℃恒溫箱中培養72小時
*注意：接種后用振蕩器振蕩混勻試管中的液體。
5.6滴定：從恒溫箱中取出后，將試管中培養液倒入50ml三角瓶中，用5ml0.004%溴麝香草酚藍分二次淋洗試管，洗液倒入該三角瓶中，以0.1mol/L氫氧化鈉溶液滴定，呈綠色即為終點，此時PH約6.8，繪制尼克酸標準工作曲線，用測定管得到的值，在標準曲線上查到測定管內所含尼克酸的量。
* 水解液的PH值調至6.8是為了不同的試劑加入基本培養基時，不致改變基本培養基的PH值。（此乳酸菌生長的適宜PH值為6.8）
6.計算
以尼克酸標準系列的不同微克數為橫坐標，滴定所需0.1mol/L氫氧化鈉 毫升數為縱坐標，作為標準曲線。
X=（C×V/m）×F×（100/1000）
X--樣品中尼克酸的含量，mg/100g；
C--每毫升樣品中尼克酸含量的平均值，ug/ml；
V--樣品水解液定容總體積，ml；
F--樣品試液的稀釋倍數；
m--試樣質量，g；
100/1000--折算成每100g樣品中尼克酸含量，mg。
7.舉例
取一螺旋藻樣品1.004g（m），處理后定容為100ml（V），從中取1ml稀釋至25ml（F），取1，2，3，4ml入試管中，加入水和培養基，高壓消毒，培養，滴定，測量根據曲線分別得出四管C值為0.037，0.073，0.110，0.136，所以四管平均值為C=（0.037+0.073/2+0.110/3+0.136/4）/4=0.036。代入方程式為：
X=（C×V/m）×F×（100/1000）=（0.036×100/1.004）×25×（100/1000）=8.96（mg/100g）
因此得出每100克螺旋藻中含8.96毫克尼克酸。
8.注意事項
（1） 當管中尼克酸的量少于0.05或多于0.3ug，即超過標準曲線范圍時所得到的數值不能用于計算。
（2） 3mol/L鹽酸的配制方法：取250ml濃鹽酸，加入750ml蒸餾水，共配成1L 3mol/L的鹽酸
（3）試管應先用洗衣粉清洗后，用水沖凈，再放入酸缸中浸泡1天左右，撈出后再用自來水和蒸餾水清洗干凈，涼干，方可再用。

二、比色法
1.原理
煙酸和煙酰胺于Ph=4.5下用稀NH4OH提取，再與CNBr溶液與10％對氨基苯磺酸反應，測其比色值。
2.適用范圍
選自AOAC；適用范圍：適用于藥物、食物和飼料
3.儀器設備
（1） 容量瓶，100ml
（2） 錐形瓶，250ml
（3） 電熱板
（4） 高壓釜（121℃，30min）
（5） 離心管，5ml
（6） 漏斗
（7） 通風櫥
（8） 酸式滴定管
比色計（藥物430-450nm，谷物470nm）
4.試劑
所用試劑皆為分析純；所用水皆為蒸餾水
4.1尼克酸標準溶液
（1） 尼克酸標準儲備液（100μg/ml）：將50mgUSP煙道參比標準（貯于P2O5干燥器中，放于暗處保存。）
（2） 標準中間液Ι（10μg/ml）：取少量貯備液放置至室溫。用蒸餾水將10.0ml貯備液稀釋至100ml。
（3） 標準工作液Π（4μg/ml）：將恢復至室溫的貯備液2.0ml用蒸餾水稀釋至50ml。
4.2其它試劑
（1） 稀氫氧化銨溶液：5mlNH4OH用H2O稀釋至250ml
（2） 稀鹽酸：V+V=1+5
（3） 磷酸緩沖液（pH＝8）：將60gNa2HPO4·7H2O和10gKH2PO4溶于蒸餾水中并稀釋至200ml。
（4）溴化氫溶液（10%，通風櫥中制備）：將370mlH2O溫熱至40℃，并加入40gCNBr。振蕩至溶解冷卻并稀釋至400ml。溶液在冰箱保存。
*CNBr劇毒，切勿與皮膚接觸，必須在通風櫥中操作。
（5）10%對氨基苯磺酸溶液：按每次1ml將NH4OH加到20g對氨基苯磺酸和170ml蒸餾水的混合液中，直至酸溶解為止。用鹽酸與蒸餾水溶液（1：1）調節pH至4.5，采用溴甲酚綠指示劑指示。稀釋至200ml。
*注：因為溶液有顏色會影響最后結果，所以稀釋結束后溶液應幾乎無色
（6）55%對氯基苯磺酸溶液：在55g對氨基苯磺酸中加入27ml蒸餾水和27mlNH4OH，振搖至溶解。（必要時加溫）。用NH4OH或5NHCl調pH為7，再用蒸餾水稀釋至100ml。（保存在暗處）
5.操作步驟
5.1樣品制備
（1）藥物：將藥品研碎，溶于蒸餾水中，稀釋定容。取10mL樣品于錐形瓶中，加入10mLHCl，在電熱板上加熱蒸發至約2mL，冷卻，加入25-50mL蒸餾水，用40%NaOH或KOH溶液調節pH值至2.5-4.5。過濾，棄去10mL處液，轉移至容量瓶中定容，使溶液含尼克酸約4μg/mL。
*注：溶液的尼克酸含量應在50-200μg/mL
（2）非谷類食品及飼料：稱取約28g樣品，加入0.5mol/LH2SO4200mL，混勻，在高壓釜中121℃加熱半個小時。冷卻，用10mol/LNaOH調節pH值至4.5，以溴甲酚綠作外指示劑，用蒸餾水稀釋至250mL，過濾。取17g（NH4）2SO4于50mL容量瓶中，吸取40mL樣品液，用H2O稀釋定容，強力振搖。過濾，混勻，取1mL作比色測定用。如果樣品中尼克酸含量為16mg/1b。最終液濃度3.2μg/mL。
移取40mL標準工作液Π至盛有17g （NH4）2SO4的50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，此液含尼克酸3.2μg/mL。
*注：加入H2SO4主要是為了去除樣品中的蛋白及其它雜質，以防其對測量結果造成影響
（3）谷類產品：隨同樣品做1試劑空白和5個濃度的工作標準液。
分別將1.5gCa（OH）2放入7個錐形瓶中，移入0、5、10、15、20、25mL標準中間液Ι和2.5g樣品（含100μg煙酸），加入蒸餾水至90mL，振搖混勻。高壓121℃下2小時。趁熱混勻，冷卻至40℃，轉移至100mL容量瓶中，稀釋定容。
從容量瓶移50mL上清液至離心管中，冰浴15min或置于冰箱中≥2小時。離心15min，吸取20mL上清液至盛有8g（NH4）2SO4和2mL磷酸鹽緩沖液的離心管中。振蕩溶解并溫熱至55-60℃。離心5min，過濾。
5.2操作程序
（1）藥物制劑和非谷類食物和飼料：假如10%的對氨基苯磺酸溶液，CNBr溶液，在通風櫥中用酸式滴定管滴入，用標準工作液Π，如下表制備各管：

試劑標準空白 樣品空白
標準溶液（mL） 1.0 1.0
H2O（mL） 5.0 5.0
稀NH4OH（mL） 0.5 0.5
10%對氨基苯磺酸 2.0 2.0
稀HCl（mL） 0.5 0.5
樣品溶液
標準溶液（mL） 1.0 1.0
稀NH4OH（mL） 0.5 0.5
CNBr（mL） 5.0 5.0
10%對氨基苯磺酸（mL） 2.0 2.0
H2O（mL） 0.5 0.5

*注：CNBr有毒，注意通風
每只樣品都要分別制備樣品空白。
將標準和樣品移入試管中，分別加入5mL蒸餾水作為標準空白和樣品空白。轉動試管內的液體，立即加入稀NH4OH，轉動，加對氨基苯磺酸，再次旋轉混合。立即加入0.5mL稀HCl，混勻，置于光電比色計上，加入對氨基苯磺酸后約30s內在430和450nm波長之間任意波長調節儀器至0的A值。從加入稀NH4OH開始按標準空白同樣的方法處理標準溶液。立即轉動管子，加CNBr溶液并再次轉動混勻，在加入CNBr溶液后30s后轉動管子，加入對氨基苯磺酸溶液，再轉動。立即加入0.5mL蒸餾水，混勻，加塞。，測量。（加入對氨基苯磺酸溶液后1.5min時顏色最深，保留2min，然后慢慢褪色。）
將樣品空白設在0A，測樣品溶液的A值。若標準和樣品液含量大致相等，則尼克酸含量與A值成正比。
（2）谷類制品：取5只試管，其中兩只加入5mL標準液，兩只加入5mL樣品液，另一只加入5mL蒸餾水做試劑空白。于一只空白管，一只標準管和一只樣品管各加10mL蒸餾水，將所有管置于冰中冰浴30min。對剩下的管按順序加入10mL冷的CNBr，30s后加入1.0mL55%對氨基苯磺酸溶液。
用標準空白在470nm處，調比色計為0A，加入對氨基苯磺酸后12-15min讀出其它各管的A值。
*放入比色計前，試管必需冷卻一致，每管必需拭干。如管呈霧狀，浸于熱水中片刻，測定前拭干。
6.計算
將扣除試劑空白的標準A對尼克酸含量μg/ml作圖，畫出適宜的直線，從此圖上求出已扣除樣品空白和試劑空白后樣品校正的A所對應的濃度C。
Mg尼克酸/g樣品=C/10ng樣品
7. 注意事項
（1） CNBr溶液有毒，要注意安全。
（2） 樣品不同，處理方法不同，不要混淆。
（3） 注意通風櫥的通風。
（4） 因為采用比色法測量，因此樣品含有色素易干擾測定，影響測定結果的正確性。
（5）試管應先用洗衣粉清洗后，用水沖凈，再放入酸缸中浸泡1天左右，撈出后再用自來水和蒸餾水清洗干凈，涼干，方可再用。

三、復合維生素制劑中的煙酰胺測定----分光光度法
1.原理
在PH約4.5處將煙酰胺抽提到KH2PO4溶液中，再與CNBr和巴比士酸反應。用分光光度法測定反應產物。煙酸含量超過煙酰胺三倍量時干擾煙酰胺測定。
2.適用范圍
選自AOAC；適用于復合維生素制劑檢測
3.儀器
（1） 攪拌器
（2） 量筒
（3） 錐形瓶
（4） 高壓釜（121℃，15min）
分光光度計（550nm）
4.試劑
所用試劑皆為分析純；所用水皆為蒸餾水
4.1.煙酰胺標準溶液：
（1） 標準儲備液（250μg/mL）：50mgUSP煙酰胺標準加60%乙醇溶解并稀釋到200mL。在10℃貯存。
（2）標準工作液（5μg/mL）：將少量貯備液溫熱至室溫。取出2mL用0.3%KH2PO4溶液稀釋至100mL。

4.2其它試劑
（1）溴化氰溶液：10%，將370mlH2O溫熱至40℃，并加入40gCNBr。振蕩至溶解冷卻并稀釋至400ml。溶液在冰箱保存。使用前需恢復到室溫。
*注：CNBr劇毒，切勿與皮膚接觸，注意在通風櫥 中操作。
（2） 磷酸二氫鉀溶液：
A. 13%的磷酸二氫鉀溶液：將30gKH2PO4用蒸餾水溶解并稀釋到1L。
B. 3%的磷酸二氫鉀溶液：將3%的磷酸二氫鉀溶液用蒸餾水稀釋（1+9）。
（3）巴比土酸緩沖液：按每批測定需用量計算，按每100mL3%KH2PO4溶液加2g試劑級巴比土酸制備。攪拌1小時，用前過濾。
5.操作步驟
5.1樣品制備：取適量樣品于錐形瓶中，加入0.3%的KH2PO4（KH2PO4的量至少是估計的煙酰胺量的兩倍）。若樣品不易溶解，則振搖使其分散并用高壓釜在121℃下加熱15min。用0.3%KH2PO4溶液稀釋至5μg/mL。過濾。
用蒸餾水代替CNBr分別制備各樣品的空白。
將1mL工作標準液或測定液置于分光光度計比色管中。加0.5mLCNBr溶液，混勻，塞住，放置25-30min，加10mL巴比土酸溶液并旋搖
*注：若30min后不能加巴比土酸溶液。將管置于碎冰浴中穩定CNBr反應。
5.2用蒸餾水代替CNBr做為適當的空白，（550nm，分光光度計設定在0A）顏色最深時測定反應產物的吸光度
*注：加入巴比土酸后2-4min時顏色最深，穩定約1min，慢慢褪去
*注：測定樣品時，其放置時間不應超過30min。加入CNBr時應有規律的間隔1-2min。
6.計算
樣品中煙酰胺含量（mg）=（A×5×稀釋倍數）/（A'×1000）
式中
A- 樣品吸光度
A'--標準吸光度
5-μg煙酰胺/mL標準工作液
（結果用煙酰胺mg/片報告）
7.注意事項
（1） CNBr有毒，應在通風櫥中操作。
（2） 樣品中煙酸含量超過煙酰胺含量的三倍量時會干擾煙酰胺的測定，因此樣品應有明確的煙酸和煙酰胺的含量。
（3）試管應先用洗衣粉清洗后，用水沖凈，再放入酸缸中浸泡1天左右，撈出后再用自來水和蒸餾水清洗干凈，涼干，方可再用。