一、高錳酸鉀滴定法
1.原理
樣品經(jīng)除去蛋白質(zhì)后，其中還原糖在堿性環(huán)境下將銅鹽還原為氧化亞銅，加硫酸鐵后，氧化亞銅被氧化為銅鹽，以高錳酸鉀溶液滴定氧化作用后生成的亞鐵鹽，根據(jù)高錳酸鉀消耗量計算氧化亞同含量，再查表得還原糖量。
2.適用范圍
GB5009.7-85，本法適用于所有食品中還原糖的測定以及通過酸水解或酶水解轉化成還原糖的非還原性糖類物質(zhì)的測定。
3.儀器
（1） 滴定管
（2） 25ml古氏坩堝或G4垂融坩堝
（3） 真空泵
（4） 水浴鍋
4.試劑
除特殊說明外，實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純。
4.1 6 mol/L鹽酸：量取50ml鹽酸加水稀釋至100 ml。
4.2 甲基紅指示劑：稱取10mg甲基紅，用100ml乙醇溶解。
4.3 5 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取20g氫氧化鈉加水溶解并稀釋至100ml。
4.4 堿性酒石酸銅甲液：稱取34.639g硫酸銅（CuSO4·5H2O），加適量水溶解，加0.5ml硫酸，再加水稀釋至500ml，用精制石棉過濾。
4.5堿性酒石酸銅乙液：稱取173g酒石酸鉀鈉與50g氫氧化鈉，加適量水溶解，并稀釋至500ml，用精制石棉過濾，貯存于橡膠塞玻璃瓶中。
4.6精制石棉：取石棉先用3mol/L鹽酸浸泡2～3天，用水洗凈，再加2.5mol/L氫氧化鈉溶液浸泡2～3天，傾去溶液，再用熱堿性酒石酸銅已液浸泡數(shù)小時，用水洗凈。再以3mol/L鹽酸浸泡數(shù)小時，以水洗至不呈酸性。然后加水振搖，使成微細的漿狀軟縣委，用水浸泡并貯存于玻璃瓶中，即可用做填充古氏坩堝用。
4.7 0.1000mol/L高錳酸鉀標準溶液。
4.8 1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4g 氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至100ml。
4.9 硫酸鐵溶液：稱取50g硫酸鐵，加入200ml水溶解后，慢慢加入100ml硫酸，冷卻后加水稀釋至1L。
4.10 3mol/L鹽酸：量取30ml鹽酸，加水稀釋至120ml。
5. 操作方法
5.1 樣品處理：
5.1.1 乳類、乳制品及含蛋白質(zhì)的食品：稱取約0.5～2 g固體樣品（吸取2～10 ml液體樣品），置于250 ml容量瓶中，加50ml水，搖勻。加入10 ml堿性酒石酸銅甲液及4ml1mol/L氫氧化鈉溶液，加水至刻度，混勻。靜置30min，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。（注：此步驟目的是沉淀蛋白）
5.1.2 酒精性飲料：吸取100 ml樣品，置于蒸發(fā)皿中，用1mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，在水浴上蒸發(fā)至原體積1/4后（注：如果蒸發(fā)時間過長，應注意保持溶液pH為中性），移入250ml容量瓶中。加50 ml水，混勻。以下按5.1.1自"加10ml堿性酒石酸銅甲液"起依法操作。
5.1.3 含多量淀粉的食品：稱取2～10 g樣品，置于250 ml容量瓶中，加200 ml水，在45℃水浴中加熱1h，并時時振搖。（注意：此步驟是使還原糖溶于水中，切忌溫度過高，因為淀粉在高溫條件下可糊化、水解，影響檢測結果。）冷卻后加水至刻度，混勻，靜置。吸取200ml上清液于另一250 ml容量瓶中，以下按5.1.1自"加10ml堿性酒石酸銅甲液"起依法操作。
5.1.4 含有脂肪的食品：稱取2～10g樣品，先用乙醚或石油醚淋洗3次，去除醚層。加入50ml水混勻，以下按5.1.1自"加10ml堿性酒石酸銅甲液"起依法操作。
5.1.5 汽水等含有二氧化碳的飲料：吸取100 ml樣品置于蒸發(fā)皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入250ml容量瓶中，并用水洗滌蒸發(fā)皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻后，備用。
5.2 樣品測定：
吸取50ml處理后的樣品溶液，于400ml燒杯中，加入25ml堿性酒石酸銅甲液及25ml乙液，于燒杯上蓋一表面皿，加熱，控制在4min內(nèi)沸騰，再準確煮沸2min，乘熱用鋪好石棉的古氏坩堝或G4垂融坩堝抽濾，并用60℃熱水洗滌燒杯及沉淀，至洗液不成堿性為止。（注：還原糖與堿性酒石酸銅試劑的反應一定要在沸騰狀態(tài)下進行，沸騰時間需嚴格控制。煮沸的溶液應保持藍色，如果藍色消失，說明還原糖含量過高，應將樣品溶液稀釋后重做。）將古氏坩堝或垂融坩堝放回原400ml燒杯中，加25ml硫酸鐵溶液及25ml水，用玻棒攪拌使氧化亞銅完全溶解，以0.1mol/L高錳酸鉀標準液滴定至微紅色為終點。
同時吸取50ml水，加與測樣品時相同量的堿性酒石酸銅甲、乙液，硫酸鐵溶液及水，按同一方法做試劑空白實驗。
6. 計算：
X1=（V-V0）×N×71.54 （1）
式中： X1--樣品中還原糖質(zhì)量相當于氧化亞銅的質(zhì)量，mg；
V--測定用樣品液消耗高錳酸鉀標準液的體積，ml；
V0--試劑空白消耗高錳酸鉀標準液的體積，ml；
N--高錳酸鉀標準溶液的濃度；
71.54--1ml 1mol/L高錳酸鉀溶液相當于氧化亞銅的質(zhì)量，mg。
根據(jù)（1）式中計算所得氧化亞銅質(zhì)量，查附表"氧化亞銅質(zhì)量相當于葡萄糖、果糖、乳糖、轉化糖的質(zhì)量表"，再計算樣品中還原糖含量。
X2=（m1×V2）∕（m2×V1）×（100∕1000） (2)
式中： X2--樣品中還原糖的含量，g/100g（g/100ml）；
m1--查表得還原糖質(zhì)量，mg；
m2--樣品質(zhì)量（或體積）， g（ml）；
V1--測定用樣品處理液的體積，ml；
V2--樣品處理后的總體積，ml。
7.舉例：
稱取某食物樣品3.00g，經(jīng)過處理后用水定容至250ml。取50ml進行測定，消耗0.1003mol/L高錳酸鉀標準液5.20ml，同時測試劑空白為0.36ml，則 樣品中還原糖質(zhì)量相當于氧化亞銅的質(zhì)量為：
X1（mg） =（5.20-0.36）×0.1003×71.54 = 34.73
查表得還原糖質(zhì)量為相當于葡萄糖16.22 mg，
樣品中還原糖含量（以葡萄糖計）為：
X2（g/100g）=（16.22×250）∕（3.00×50）×（100∕1000）= 2.70
8.注釋：
本法用堿性酒石酸銅溶液作為氧化劑。由于硫酸銅與氫氧化鈉反應可生成氫氧化銅沉淀，氫氧化銅沉淀可被酒石酸鉀鈉緩慢還原，析出少量氧化亞銅沉淀，使氧化亞銅計量發(fā)生誤差，所以甲、乙試劑要分別配制及貯藏，用時等量混合。
二、直接滴定法
1.原理
樣品經(jīng)除去蛋白質(zhì)后，在加熱條件下，直接滴定已標定過的費林氏液，費林氏液被還原析出氧化亞銅后，過量的還原糖立即將次甲基藍還原，使藍色褪色。根據(jù)樣品消耗體積，計算還原糖量。
2.適用范圍
GB5009.7-85，本方法適用于所有食品中還原糖的檢測。檢出限0.1mg。
3.主要儀器
滴定管
4.試劑
除特殊說明外，實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純。
（1） 費林甲液：稱取15 g硫酸銅（CuSO4·5H2O），及0.05 g次甲基藍，溶于水中并稀釋至1 L。
（2） 費林乙液：稱取50 g酒石酸鉀鈉與75 g氫氧化鈉，溶于水中，再加入4 g亞鐵氰化鉀，完全溶解后，用水稀釋至500ml，貯存于橡膠塞玻璃瓶內(nèi)。
（3） 乙酸鋅溶液：稱取21.9 g乙酸鋅，加3 ml冰乙酸，加水溶解并稀釋至100 ml。
（4）亞鐵氰化鉀溶液。稱取10.6g亞鐵氰化鉀，用水溶解并稀釋至100ml。
（5） 鹽酸。
（6） 葡萄糖標準溶液：精密稱取1.000 g經(jīng)過80 ℃干燥至恒量的葡萄糖（純度在99%以上），加水溶解后加入5ml鹽酸，并以水稀釋至1 L。此溶液相當于1 mg/ml葡萄糖。（注：加鹽酸的目的是防腐，標準溶液也可用飽和苯甲酸溶液配制）
5.操作方法
5.1樣品處理：
5.1.1乳類、乳制品及含蛋白質(zhì)的食品：稱取約0.5～2 g固體樣品（吸取2～10 ml液體樣品），置于100 ml容量瓶中，加50ml水，搖勻。邊搖邊慢慢加入5 ml乙酸鋅溶液及5 ml亞鐵氫化鉀溶液，加水至刻度，混勻。靜置30min，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。（注意：乙酸鋅可去除蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂等，使它們形成沉淀，經(jīng)過濾除去。如果鈣離子過多時，易與葡萄糖、果糖生成絡合物，使滴定速度緩慢；從而結果偏低，可向樣品中加入草酸粉，與鈣結合，形成沉淀并過濾。）
5.1.2酒精性飲料：吸取50 ml樣品，置于蒸發(fā)皿中，用1mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，在水浴上蒸發(fā)至原體積1/4后，移入100 ml容量瓶中。加25ml水，混勻。以下按4.1.1自"加5 ml乙酸鋅溶液"起依法操作。
5.1.3含多量淀粉的食品：稱取2～5 g樣品，置于100 ml容量瓶中，加50 ml水，在45℃水浴中加熱1h，并時時振搖（注意：此步驟是使還原糖溶于水中，切忌溫度過高，因為淀粉在高溫條件下可糊化、水解，影響檢測結果。）。冷后加水至刻度，混勻，靜置。吸取50ml上清液于另一100 ml容量瓶中，以下按4.1.1自"5 ml乙酸鋅溶液"起依法操作。
5.1.4汽水等含有二氧化碳的飲料：吸取50 ml樣品置于蒸發(fā)皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入100ml容量瓶中，并用水洗滌蒸發(fā)皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻后，備用。
（注意：樣品中稀釋的還原糖最終濃度應接近于葡萄糖標準液的濃度。）
5. 2標定費林氏液溶液：吸取5.0 ml費林氏甲液及5.0 ml乙液，置于150ml錐形瓶中（注意：甲液與乙液混合可生成氧化亞銅沉淀，應將甲液加入乙液，使開始生成的氧化亞銅沉淀重溶），加水10ml，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加約9 ml葡萄糖標準溶液，控制在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸以每兩秒1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標準溶液，直至溶液蘭色剛好褪去并出現(xiàn)淡黃色為終點，記錄消耗的葡萄糖標準溶液總體積，平行操作三份，取其平均值，計算每10ml（甲、乙液各5ml）堿性酒石酸銅溶液相當于葡萄糖的質(zhì)量（mg）。（注意：還原的次甲基藍易被空氣中的氧氧化，恢復成原來的藍色，所以滴定過程中必須保持溶液成沸騰狀態(tài)，并且避免滴定時間過長。）
5.3樣品溶液預測：吸取5.0 ml費林氏甲液及5.0 ml乙液，置于150 ml錐形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，控制在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸以先快后慢的速度，從滴定管中滴加樣品溶液，并保持溶液沸騰狀態(tài)，待溶液顏色變淺時，以每秒1滴的速度滴定，直至溶液蘭色褪去，出現(xiàn)亮黃色為終點。如果樣品液顏色較深，滴定終點則為蘭色褪去出現(xiàn)明亮顏色（如亮紅），記錄消耗樣液的總體積。（注意：如果滴定液的顏色變淺后復又變深，說明滴定過量，需重新滴定。）
5.4樣品溶液測定：吸取5.0 ml堿性酒石酸銅甲液及5.0 ml乙液，置于150 ml錐形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，在2min內(nèi)加熱至沸，快速從滴定管中滴加比預測體積少1ml的樣品溶液，然后趁沸繼續(xù)以每兩秒1滴的速度滴定直至終點。記錄消耗樣液的總體積，同法平行操作兩至三份，得出平均消耗體積。
6.計算
X3 =（C×v1 × V）∕（m× v2 ×1000）×100
式中： X--樣品中還原糖的含量(以葡萄糖計)，%；
C--葡萄糖標準溶液的濃度，mg/ml；
v1-- 滴定10 ml費林氏溶液（甲、乙液各5 ml）消耗葡萄糖標準溶液的體積，ml；
v2--測定時平均消耗樣品溶液的體積，ml；
V--樣品定容體積，ml；
m--樣品質(zhì)量，g；
7.注意事項
（1）本方法測定的是一類具有還原性質(zhì)的糖，包括葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖等，只是結果用葡萄糖或其他轉化糖的方式表示，所以不能誤解為還原糖=葡萄糖或其他糖。但如果已知樣品中只含有某一種糖，如乳制品中的乳糖，則可以認為還原糖=某糖。
（2）分別用葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖標準品配制標準溶液分別滴定等量已標定的費林氏液，所消耗標準溶液的體積有所不同。證明即便同是還原糖，在物化性質(zhì)上仍有所差別，所以還原糖的結果只是反映樣品整體情況，并不完全等于各還原糖含量之和。如果已知樣品只含有某種還原糖，則應以該還原糖做標準品，結果為該還原糖的含量。如果樣品中還原糖的成分未知，或為多種還原糖的混合物，則以某種還原糖做標準品，結果以該還原糖計，但不代表該糖的真實含量。