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  • 高效液相色譜法測定蜂王漿中羥甲基糠醛含量

    發布于 2011/08/15閱讀(1786)來源 zxj標簽 液相色譜儀

    摘要

    高效液相色譜法測定蜂王漿中羥甲基糠醛含量

    內容

    本實驗在參考前人研究的基礎上,對提取方法、線性范圍、方法適用性等方面進行研究,結合實際樣品的測定,建立一種穩定、靈敏度高、適應性好的蜂王漿中羥甲基糠醛含量的測定方法。
    1 材料與方法
    ※分析檢測食品科學2008, Vol. 29, No. 03 413
    1.1 儀器與試劑
    P 6 8 0 高效液相色譜儀 D i n o e x 公司;固相萃小柱ENVI-C18(500mg,6ml);固相萃取裝置 Supelco 公司;Turbo Vap LV 氮氣吹干儀;離心機 Sigma 公司。羥甲基糠醛標準品(97.0%) Sigma公司;磷酸(優級純) ;甲醇(色譜純) ;乙酸鋅溶液(150g/L);亞鐵氰化鉀溶液(300g/L);10% 的甲醇水溶液(10ml 甲醇與90ml水混合);實驗用水為超純水。
    標準溶液的配制:準確稱取標準品,用去離子水
    配制成0.5mg/ml 的儲備液。分析前用流動相配制成一系列不同濃度的標準工作溶液。
    1.2 樣品處理
    稱取5g 試樣,精確到0.001g,置于50ml 容量瓶中,加入30ml 水振蕩溶解。待樣品溶解后,分別加入3ml 乙酸鋅溶液和3 m l 亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白,用水定容至刻度,混勻,靜置1 0 m i n 。將溶液轉移到離心管中,在5 0 0 0 r / m i n 離心1 0 min,取上清液,待凈化。將E N V I - C 1 8 萃取柱固定在萃取裝置上,分別加入5ml 甲醇、10ml 純水活化平衡,保持柱的濕潤。取15ml濾液到固相萃取柱中,上清液以不大于3ml/min 流速通過固相萃取柱,待液體完全流完后,用5 m l 1 0 % 甲醇水溶液清洗固相萃取小柱;真空減壓抽干后,用5 m l 甲
    醇洗脫于1 0 m l 刻度試管中。將洗脫液用氮吹儀吹干后,用0.5ml 流動相溶解,樣液經過0.45μm 的濾膜過濾后,上液相色譜儀測定。
    1.3 液相色譜條件
    色譜柱: Waters Symmetry-C18(4.6mm × 250mm,5μm ,W a t e r s 公司);流動相:0 . 4 % 磷酸水溶液+ 甲醇(90+10);流速0.8ml/min;檢測波長285nm;柱溫30℃;進樣量2 0μl。
    2 結果與分析
    2.1 提取方法的優化
    2.1.1 沉淀劑的選擇
    常用的沉淀蜂王漿蛋白的試劑有無水乙醇溶液,磷酸溶液,鹽酸溶液,偏磷酸溶液,乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液等,經過實驗,這些溶液均能很好的將蜂王漿中的蛋白沉淀。但由于羥甲基糠醛對強酸,熱和氧化劑敏感,當用磷酸、鹽酸、偏磷酸溶液時,羥甲基
    糠醛的回收率很低,有可能在提取過程中,發生了分解。8 0 % 的乙醇水溶液對蜂王漿中羥甲基糠醛提取有很高的回收率,但在進一步凈化前,需要用蒸發儀蒸干,而由于乙醇和水的混合液沸點很高,需要長時間的揮發,這不僅延長了測試樣品的時間,而且在揮發的過程中羥甲基糠醛很容易降解,因此本實驗選擇乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液作為沉淀劑。通過優化實驗確認,乙酸鋅溶液的濃度為150g/L;亞鐵氰化鉀溶液濃度為300g/L,各使用3 m l 就可以有效的將蜂王漿中蛋白沉淀,并獲得很好的提取回收率。
    2.1.2 固相萃取小柱的選擇
    對比了BAKERBOND SPETM C18(500mg/6ml);ODS(C18)PHASE(500mg/6ml);ACCUBOND ODS(C18)(500mg/6ml);Oasis HLB(500mg/6ml)小柱和ENVI-C18(500mg/6ml)五種反相固相萃取柱對蜂王漿樣品的凈化效果。實驗表明,五種固相萃取柱差異較大,EN V I - C 1 8 小柱的回收率最高(90% 以上),Oasis HLB 和BAKERBOND SPETM C18的回收率在7 5 %~8 5 %,O D S ( C 1 8) P H A S E 和A C C U B O N DO D S ( C 1 8 )柱的回收率在6 0 %~8 0 %。因此,本方法選擇E N V I - C 1 8 固相萃取柱為凈化柱。
    2.2 液相色譜柱的選擇
    分別選用Symmetry C18 (4.6mm × 250mm,5μm),Diamonsil C18 (4.6mm × 250mm,5μm),Waters Nova-Pak C18 (3.9mm × 150mm,5μm),μBondapak C18 (4.0mm× 3 0 0 m m,1 0μm )四種色譜柱對蜂王漿中羥甲基糠醛進行了色譜條件的實驗。實驗發現,這四種色譜柱都可以用于對羥甲基糠醛含量的分析,只有保留時間和靈敏度有所不同,Symmetry C18 柱靈敏度和峰型均很好,所以我們選用Symmetry C18 (4.6mm × 250mm,5μm)色譜柱進行羥甲基糠醛的測定。標準圖譜與實際樣品分離圖譜
    見圖1 。
    2.3 線性關系和檢出限
    用羥甲基糠醛標準儲備溶液分別配制濃度為0 . 1 0、0.20、1.0、2.0、5.0、20.0mg/L 標準溶液,在選定的色譜條件下進行測定,進樣量2 0μl ,用峰高與標準濃度作圖,線性方程為Y=2.3772X+0.024,線性相關系數R2=0.9993。當檢測0.10mg/L 標準濃度時,所測譜圖的信噪比大于1 0 。根據最終樣液所代表的試樣量、定容體積和進樣量計算,確定本方法檢出限為0 . 2 m g / k g。
    2.4 回收率和精密度
    在樣品上做0.2、1、5、10mg/kg 四個添加水平的加標回收率實驗,每個濃度重復四次,測定的平均回收率及精密度見表1。在0.2~10mg/kg 添加濃度范圍內,回收率在87.2%~93.1% 之間,相對標準偏差小于3.4%,能夠滿足蜂王漿中羥甲基糠醛含量的常規分析。
    2.5 實際樣品的測定
    添加濃度 (mg/kg) 0.2 1 5 10
    回收率Intra-daya 89.4±3.4 89.2±2.1 92.2±2.3 93.1±1.1
    (%, X ± SD) Inter-dayb 87.2±3.1 91.7±3.2 91.2±2.7 92.3±2.5
    表 1 蜂王漿中羥甲基糠醛的添加回收率
    Table 1 Recoveries of hydroxymethylfurfural in royal jelly
    注:Intra-daya 為日內添加回收率,測定4次;Inter-dayb 為日間添加回
    收率,測定4 次。
    414 2008, Vol. 29, No. 03 食品科學※分析檢測
    隨機從市場上購買的蜂王漿樣品1 4 個,采用本實驗建立的高效液相色譜方法對樣品進行分析,實際測定
    結果見表2 。
    結果表明,大多數樣品中都檢出了羥甲基糠醛,檢出樣品中羥甲基糠醛的含量在0.9~26.4mg/kg 之間。
    羥甲基糠醛有可能能成為評價蜂王漿質量和貯存效果的指標之一。
    3 結 論
    蜂王漿樣品基質復雜,富含蛋白質、脂類等物質。本實驗采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉降蛋白,結合固相萃取方法,有效地降低了基質干擾。方法回收率在87.2%~93.1% 之間,相對標準偏差為0.9%~3.4%,該方法具有方便、準確、靈敏度高、精密度好等優點,是一種測定蜂王漿中羥甲基糠醛的有效方法。
     

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