總膽堿的測(cè)定方法
比色法
1.原理
食物中的膽堿經(jīng)過堿處理提取后，通過Florisil柱色譜純化，然后用雷納克鹽（reineckate）與膽堿反應(yīng)形成粉紅色的膽堿-雷納克鹽復(fù)合物，這種復(fù)合物被丙酮洗脫后，在526nm有最大吸收，其吸收值與膽堿濃度成正比。
2.適用范圍
參照《Methods of Vitamin Assay》。使用于各類食物中膽堿的測(cè)定。最小檢出限為0.15mg。
3. 儀器與設(shè)備
（1） 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。
（2） 回流提取裝置。
（3）色譜柱：為0.8cm（內(nèi)徑）×30cm的玻璃柱，柱上端為容積30～50ml的儲(chǔ)液池，底端收縮變細(xì)，并裝有活塞。活塞上約1cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm。
（4） 分光光度計(jì)。
4. 試劑
除特殊說明外，所有試劑均為分析級(jí)，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。
（1） 甲醇。
（2） 氯仿。
（3） 乙酸甲酯。
（4） 丙酮：用前重蒸餾。
（5） 10% 丙酮： 取50ml丙酮溶解于450ml水中。
（6） 冰乙酸。
（7） 冰乙酸-甲醇溶液：取50ml冰乙酸和400ml甲醇混合。
（8）飽和氫氧化鋇提取液：于1000ml甲醇中加入40g無(wú)水Ba(OH)2，攪拌10min,再加入100ml氯仿，混合，使Ba(OH)2飽和，過濾去除多余的Ba(OH)2。
（9） 硅鎂吸附劑（Florisil）：Sigma 公司，60～100目。
（10） 雷納克銨（AmmoniumReineckate）飽和溶液：稱取2～3g雷納克銨，加入100ml水中，攪拌10min,過濾去除多余的雷納克銨。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日配制。
（11） 膽堿標(biāo)準(zhǔn)貯備液（5g/L）：準(zhǔn)確稱取無(wú)水氯化膽堿0.57613g，溶解于水中，并定容至100mL。冰箱保存。
（12） 膽堿標(biāo)準(zhǔn)工作液（1g/L）：準(zhǔn)確吸取2.0ml標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用水稀釋定容至100ml。
5.測(cè)定步驟
所有操作均需避光進(jìn)行
5.1提取：稱取適量樣品（約含5～50mg膽堿），置于100ml具塞錐型瓶中，加入30ml提取液，邊加邊搖，避免結(jié)塊。然后放置于76℃～80℃恒溫水浴回流2～4h，回流速度為1～2滴/秒。（注：加熱回流的溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在80℃左右，否則樣品易撲濺，造成損失。樣品提取率與回流時(shí)間有關(guān)，回流2小時(shí)，提取率達(dá)到最高值，回流3～4小時(shí)，可以保證樣品提取較完全。）冷卻，樣品過濾至100ml容量瓶中，反復(fù)用5～10ml冰乙酸-甲醇溶液洗滌錐形瓶和濾渣，濾液并入容量瓶中。用pH試紙測(cè)定提取液pH在2～6范圍之內(nèi)（必要的話可加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH），然后用甲醇定容至刻度。
5.2 純化
（1）填裝色譜柱：將硅鎂吸附劑浸入甲醇中，濕法將硅鎂吸附劑填充入色譜柱中（注：色譜柱最好經(jīng)過干燥處理，否則影響洗脫液流速），至硅鎂吸附劑的高度達(dá)10cm（約4g）。用甲醇沖洗色譜柱，并保持甲醇高于硅鎂吸附劑頂端0.5～1cm。
（2）柱色譜純化：吸取一定量的提取液加到色譜柱中，打開底端活塞，使提取液靠重力作用通過色譜柱。先后用5ml，10ml甲醇洗滌色譜柱。待甲醇通過色譜柱后，依次用2份10ml乙酸甲酯，10ml冷的10%丙酮洗滌色譜柱。接著加入5ml雷納克銨飽和溶液（雷納克銨與吸附于色譜柱上的膽堿結(jié)合），待雷納克銨飽和溶液完全通過色譜柱后，用2份10ml冰乙酸洗滌直至流出液清亮為止（冰乙酸的作用是洗脫未與膽堿結(jié)合的過量的雷納克銨，應(yīng)注意洗脫完全）。用15ml丙酮洗脫色譜柱上膽堿-雷納克鹽復(fù)合物的粉紅色色譜帶，收集洗脫液，并用丙酮定容至15ml。
5.3比色測(cè)定：用1cm比色杯，以丙酮調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于526cm波長(zhǎng)下，測(cè)定樣品吸光度，其值在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出，或通過回歸方程計(jì)算出對(duì)應(yīng)的膽堿含量，供計(jì)算使用。
5.4標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：分別吸取0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.13），加至色譜柱上，按照上述樣品測(cè)定步驟操作。以膽堿含量做橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。
6.計(jì)算
  C ×V1×100
X= -------- ×100
   V2 × m
式中：
X--樣品中膽堿的含量，（mg/100g）；
C--從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線或回歸方程中查到的膽堿含量，mg；
V1--樣品提取液的總體積，ml
V2--純化用提取液的體積，ml；
m--樣品質(zhì)量，g
7.注意事項(xiàng)
（1） 同一實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)定或重復(fù)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差絕對(duì)值＜10%。
（2） 硅酶吸附劑填充的高度關(guān)系到洗脫液的用量，如果填充過高，則應(yīng)加大洗脫液用量，以保證膽堿的純化和完全洗脫。
（3）純化過程中冰乙酸的作用是將不能與膽堿形成復(fù)合物的多余雷納克銨鹽洗脫，丙酮?jiǎng)t是洗脫膽堿-雷納克銨復(fù)合物，如果這兩步洗脫不完全，均影響膽堿的測(cè)定，所以必要時(shí)應(yīng)增加冰乙酸和丙酮的用量以保證測(cè)定結(jié)果。