微生物測定法
1.原理
生物素對于Lactobacillus plantarum（ATCC8014）的正常生長是一種必需的營養(yǎng)素，在一定生長條件下，Lactobacillusplantarum的生長與繁殖速度與溶液中生物素的含量成一定的線性關(guān)系，通過利用濁度法或光密度法測定細菌生長和繁殖的強度可間接地測定出食物樣品中的生物素含量。最低檢出限為0.003ng。
2.適用范圍
本方法參考"Official Methods of Analysis of the Association of officialAnalytical Chemists"、"Methods of Vitamin Analysis"以及"Methods of theMicrobiological Analysis of SelectedNutrients"。本方法適用于測定各類食物及飼料中的生物素含量。
3.試劑
本試驗所用水均為蒸餾水，所用試劑均需分析純試劑。
3.1 甲苯。
3.2 1 mol/L硫酸溶液：在600ml水中加入55.6ml濃硫酸，稀釋至1000ml。
3.3 3 mol/L硫酸溶液：在600ml水中加入166.7ml濃硫酸，稀釋至1000ml。
3.4 10mol/L氫氧化鈉溶液：溶200g氫氧化鈉于水中，定容至500ml。
3.5 1：1（1+1）乙醇溶液：500ml無水乙醇與500ml水充分混勻。
3.6 酸解酪蛋白：稱取50g不含維生素的酪蛋白于500ml燒杯中，加200ml 3mol/L鹽酸，121℃高壓水解6小時。將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，在沸水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀，如此反復(fù)3次，以去除鹽酸。以溴酚藍作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.5。加20g活性炭，振搖，過濾，如果濾液不呈淡黃色或無色，可用活性炭重復(fù)處理。濾液加水稀釋至500ml，貯存于試劑瓶中，加少許甲苯于4℃冰箱中保存。
?酸解的目的是為了消除酪蛋白中的維生素，確保基本培養(yǎng)基中不含待測定的生物素，但有時酸水解不一定徹底，所以一定要選用不含維生素的酪蛋白粉（最好為Sigma公司產(chǎn)品），這樣可較好地確保酸解酪蛋白中不含生物素。
3.7 胱氨酸、色氨酸溶液：稱取4g L-胱氨酸和1g L-色氨酸（或2gDL-色氨酸）于800ml水中，加熱至70～80℃，逐滴加入1：5（1+5）鹽酸，不斷攪拌，直至完全溶解為止。冷至室溫，加水稀釋至1000ml。加少許甲苯于4℃冰箱中保存。
3.8腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液：稱取硫酸腺嘌呤（純度為98%）、鹽酸鳥嘌呤（生化試劑）以及尿嘧啶各0.1g于250ml燒杯中，加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉淀產(chǎn)生，加鹽酸數(shù)滴，再加熱，如此反復(fù)，直至冷卻后無沉淀產(chǎn)生為止，以水稀釋至100ml，貯存于試劑瓶中，加少許甲苯于冰箱中保存。
3.9維生素溶液：稱取20mg核黃素，10mg鹽酸硫胺素，10mg對氨基苯甲酸，40mg鹽酸吡哆醇，用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.10鹽溶液：稱取10g MgSO4 7H2O、1g KCl、0.5g MnSO4 4H2O，0.5g FeSO4 7H2O加23ml 85% H3PO4，用水溶解并定容至500ml。
3.11生物素標準溶液溶液名稱
 濃度
 配置方法
 
標準

儲備溶液
 50μg / ml
 稱取25mg無水生物素用（1+1）乙醇溶液定至500ml，于4℃冰箱中貯存。
 
標準

中間液Ⅰ
 1μg / ml
 取5ml儲備液用（1+1）乙醇溶液定容至250ml，于2-4℃冰箱中貯存。
 
標準

中間液Ⅱ
 10 ng / ml
 取5ml中間液Ⅰ用（1+1）乙醇溶液定容500ml，于2-4℃冰箱中貯存
 
標準

工作液
 1 ng / ml
 取5ml中間液Ⅱ用去離子水定容至50ml，在2-4℃冰箱中貯存。
 

3.12基本培養(yǎng)基：將下列試劑混合于500ml燒杯中，加水至200ml，以溴麝香草酚藍作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH至6.8，用水稀釋至250ml。
酸解酪蛋白 25ml
胱氨酸、色氨酸溶液 25ml
腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液 5ml
維生素溶液 5ml
鹽溶液 5ml
無水葡萄糖 5g
無水醋酸鈉 5g
此培養(yǎng)基也可從Difco公司購得，產(chǎn)品號為No.0419-15-8。
?由于國內(nèi)的某些試劑的純度不夠，所以自行配制的培養(yǎng)基較渾濁，且常有刺激細菌生長的物質(zhì)存在，因此嚴重影響到最后的濁度測定結(jié)果，建議使用商品化培養(yǎng)基。
3.12瓊脂培養(yǎng)基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g無水葡萄糖，2g無水磷酸二氫鉀，100ml番茄汁，10ml吐溫-80，5.0~7.5g瓊脂，加熱溶解，用（2+3）氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5~6.8，然后定容至1000ml，分裝于試管，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出后豎直試管，待冷卻至室溫后于冰箱2-4℃保存。
3.13生理鹽水：稱取9.0g氯化鈉溶于1000ml水中，。每次使用時分別倒入2~4支10ml試管中，每支約加10ml，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，備用。
3.14 0.4g/L溴麝香草酚藍溶液：稱取0.1g溴麝香草酚藍于小研缽內(nèi)，加1.6ml 0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
3.15 0.4g/L溴甲酚綠溶液：稱取0.1g溴甲酚綠于小研缽中，加1.4ml 0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
3.16 1g/L溴酚藍乙醇溶液：稱取0.1g溴酚藍，用乙醇溶解后，加乙醇稀釋至100ml。
3.17番茄汁：將新鮮番茄去皮、去籽后，制成勻漿，用紗布多次過濾，直至濾液呈淡黃色透明液體，滴加幾滴甲苯于液體表面，放置冰箱中冷凍保存。
4.儀器與設(shè)備
（1） 實驗室常用設(shè)備
（2） 電熱恒溫培養(yǎng)箱
（3） 壓力蒸汽消毒器
（4） 液體快速混合器
（5） 離心機
（6） 分光光度計
（7） 硬質(zhì)玻璃試管：20mm×150mm
5.菌種與培養(yǎng)液的制備與保存
5.1 儲備菌種的制備：Lactobacillus plantarum（ATCC8014）接種于直面瓊脂培養(yǎng)管中，在37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~24小時，取出后放入冰箱中保存，每隔一周至少傳種一次。在實驗前一天必須傳種一次。
5.2 種子培養(yǎng)液的制備：加2ml生物素標準應(yīng)用液和3ml基本培養(yǎng)基于10ml離心管中，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出，冷卻后于冰箱中保存。每次制備兩管，備用。
? 加入離心管中的生物素標準液要適量，過少會影響Lactobacillusplantarum的生長，過多會使零管中的光密度值增大，影響測定結(jié)果的準確性。一般2～3ml標準工作掖即可。
6.操作步驟
6.1 接種液的配制：使用前一天，將已在瓊脂管中生長16～24小時的L.plantarum接種于種子培養(yǎng)液中，在37±0.5℃培養(yǎng)16～24小時，取出后離心10分鐘（3000rpm），棄去上清液，用已滅菌的生理鹽水淋洗2次，再加入3ml滅菌生理鹽水，混勻后，將此液倒入已滅菌的注射器中，立即使用。
? 菌種的淋洗一定要徹底，否則部分殘留在細菌表面的生物素會使空白管的光密度值升高，影響結(jié)果的準確性。
6.2樣品制備：稱取適量樣品，放入100ml三角瓶中，加50ml1mol/L硫酸（水解動物樣品用3mol/L硫酸，水解植物樣品及混合型樣品用1mol/L硫酸），混勻后于121℃高壓水解90分鐘，取出冷卻至室溫。以溴甲酚綠為外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為4.5，將水解液移至100ml容量瓶中，定容，過濾。樣品水解液只能在4℃冰箱保存2～3天。取適量水解液于25ml具塞刻度試管中，以溴麝香草酚藍為外指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH為6.8，用水稀釋至刻度。
6.3 樣品試管的制備:于平行樣品管中分別加入1.0、2.0、3.0、4.0ml樣品水解液，加水至5ml，然后再加入5ml基本液體培養(yǎng)基。
6.4 標準系列管的制備:每組試管中分別加入生物素標準工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，（相當于0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ng）加水至5ml，再加入5ml基本液體培養(yǎng)基，需做三組標準曲線。
6.5 滅菌：樣品管與標準系列管均用棉塞塞好，于121℃條件下高壓滅菌10分鐘
? 滅菌時間不宜過長，否則會破壞基本培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，影響Lactobacillusplantarum的生長，最好在5-10分鐘內(nèi)。
6.6 接種與培養(yǎng)：待試管冷至室溫后，每管接種一滴種子液，于37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~20小時。
?（1）接種前，接種室要在紫外燈下消毒至少30分鐘。（2）在接種時，其中一支標準系列0管可不接種，這樣可觀察此次實驗是否存在污染，并且可消除由于管中液體的顏色造成的誤差。
6.7 測定：分光光度計，波長550nm條件下，以標準系列0管調(diào)零測定樣品管及標準管的光密度值。
?首先以未接種的標準系列0管進行儀器調(diào)零，然后在用接種后的標準系列0管進行二次調(diào)零，之后再測定其他管中液體的光密度值。兩次調(diào)零的目的在于徹底消除液體本身的顏色及污染對實驗結(jié)果的影響.
7.計算
以生物素標準系列的不同納克數(shù)為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線。在曲線上查出相對應(yīng)的樣品測定管中的生物素含量，然后再按以下公式計算樣品中生物素含量：
       c·V·f
X= ---------------- ×100
       m×1000
式中 X──樣品中生物素含量，μg/100g：
c──測定管中的生物素含量，ng：
V──樣品水解液的定容體積，ml：
f──樣品液的稀釋倍數(shù)
m──樣品質(zhì)量，g。
100/1000 ── 單位換算系數(shù)
8.注意事項
在實驗過程中，一定要注意避免油脂的污染，因為當有油脂存在時，會刺激Lactobacillus plantarum（ATCC8014）快速生長，導(dǎo)致其生長速度不再與生物素的含量呈線性關(guān)系。因此在實驗前，要檢查所用玻璃器皿的表面是否已徹底清洗，操作者的雙手不要涂摸各種護手霜，以防此類油脂進入被測液體中。